医药学论文：灰树花多糖协同化疗药物抗肿瘤作用及其分子机理初探

【摘要】 目的 探讨灰树花β多糖在抗肿瘤细胞中的作用和协同化疗药物增加其杀伤肿瘤细胞的作用。另外通过对p53和MDM2的研究，发现了两者协同作用的分子机理。方法 用CCK-8方法测定了灰树花β多糖协同化疗药物处理HCT116后的细胞存活率(cell survival rate，CSR)；用PCR的方法测定了p53、MDM2基因的表达。结果 (1)灰树花β多糖对肿瘤细胞的直接杀伤作用高于灵芝多糖。(2)灰树花β多糖协同化疗药物增强其对肿瘤细胞的杀伤作用。(3)灰树花β多糖协同化疗药物的分子机理和抑制抑癌基因p53的拮抗物MDM2基因的表达相关。结论 灰树花β多糖具有直接杀伤肿瘤作用和化学药物协同抗肿瘤作用。
【关键词】 灰树花；化疗药物；p53；MDM2
【Abstract】 Objective The efficiency of anticancer therapy is limited by drug reistance.Recent studies suggest that a polysaccharide extracted from Grifola frondosa is able to kill cancer cells in vivo and in vitro.However， the molecular basis for the polysaccharide from Grifola frondosa synergistic effects with cytotoxic drugs has to be well defined.Methods HCT116 cell survival rate were monitoued by CCK-8 kit.p53 and MDM2 gene expression were checked by semiquantitative PCR analysis of cellular RNA.Results Here we showed the polysaccharide from Grifola frondosa had more great anti-cancer effect than shell-broken spores of G. lucidum in HCT116 cell.Moreover the polysaccharide from Grifola frodosa was detected synergistic effects with cytotoxic drug (ADM). Conclusion We present the evidence that anti-apoptotic gene MDM2 expression may be involved in augented the polysaccharide from Grifola frondosa induced HCT116 cells sensitivity to ADM-treatment.
【Key words】 grifola frondosa；chemotherapeutic drug；p53；MDM2
灰树花(Grifola frondosa)是一种生长在亚热带至温带的大型药、食兼用珍稀食用菌，又名栗蘑、贝叶多孔菌等，日本称之为"舞茸"。在分类学上属担子菌纲多孔菌科，其口味鲜美、营养丰富，含有众多活性物质，灰树花多糖就是最主要的一类活性成分。灰树花多糖除含有β-1，6-支链β-1，3-葡聚糖外还含有大量高度分支化的β-1，3-支链β-1，6-葡聚糖，研究表明，这种特定的结构使其拥有更强的生物调节活性［６］。作为一种生物反应调节剂(BRM)，灰树花多糖具有增强免疫功能、抑制肿瘤、抗HIV病毒、稳定血压、降低血糖、改善脂肪代谢等广泛的生理活性［１］。
灰树花β多糖具有明显的抗肿瘤作用，能激活机体免疫细胞群如T淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞，并可促进多种细胞因子的分泌如IL-2、IL-8、IL-12、γ-INF、TNF-α等，增强肿瘤局部免疫反应，抑制肿瘤发生和转移［２～４］。
化疗药物对正常细胞的毒副作用在一定程度上限制了它对恶性肿瘤的治疗作用。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 用10%牛血清(PAA Laboratories Gmbh)DMEM(PAA Laboratories Gmbh)培养液在37℃、5%CO2条件下培养人肠癌细胞系HCT116。
1.2 细胞毒性分析 取对数生长期HCT116细胞，常规消化成2×１０４/ml的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔100μl DMEM细胞培养液。5%CO2、37℃ 环境中培养24h后对HCT116细胞分别用零处理；一天灰树花β多糖(3μg/ml)；一天2μg/ml化疗药物(阿霉素2μg/ml)；二天2μg/ml化疗药物(阿霉素2μg/ml)；第一天2μg/ml化疗药物(阿霉素2μg/ml)、第二天灰树花β多糖(3μg/ml)的五种不同的方法处理，次日每孔细胞中加入5μl的CCK-8试剂，5%CO2、37℃环境中培养2h后，在酶标仪上波长450nm处读取光密度A值，计算细胞存活率(cell survival rate，CSR)。

公式

1.3 统计学处理 所有数据均以均数表示，采用t检验。
1.4 RNA抽提和RT-PCT RNeasy kit (Qiagen)提取药物处理过的HCT116细胞总RNA并合成相应的cDNA，分别对p53和Mdm2作RT-PCR，PCR产物通过琼脂糖电泳观察结果。引物序列：p53正5′-GGCCATCTACAAGCAGTCAC-3′，p53反5′-GAGAGGAGCTGGTGTTGTTG-3′；Mdm2正5′-GGTGAGGAGCAGGCAATTG-3′，Mdm2反5′-GCGTCCCTGTAGATTCACTGC-3′。
2 实验结果
2.1 灰树花β多糖直接抑制肿瘤细胞的作用 众所周知，灵芝破壁孢子粉是目前被广泛用于肿瘤患者辅助治疗各种肿瘤的一种保健药物。为了探究灰树花［１］对肿瘤细胞直接的杀伤作用［６～７］，我们用各种浓度的灵芝破壁孢子粉和灰树花β多糖对人的肠肿瘤细胞HCT116株进行处理，48h后测得肿瘤细胞HCT116的生存率，结果如图1所示，我们可以观察到与灵芝破壁孢子粉相比，灰树花β多糖对肿瘤细胞的杀伤作用更强大［８］，而且这种作用是随着剂量的递增而增强的。