医药学论文：应用PVA构建妊娠相关血浆蛋白A固相时间分辨荧光免疫试剂

［摘要］ 目的：合成(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物，并用于构建妊娠相关血浆蛋白A固相时间分辨免疫荧光试剂。方法：用PVA作为载体结合BCPDAEu3+和生物素亲和素，以双抗体夹心法原理，结合生物素标记抗体和包被抗体建立PAPPA时间分辨免疫荧光试剂，并进行方法学评价。结果：成功的合成了活性的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物，构建PAPPA试剂检测灵敏度为0.7 mIU/L；批内变异系数在3.89%～4.96%之间,批间变异系数在7.35%～9.27%之间。结论：合成的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物较高的反应活性，可以用于多种试剂的构建。构建的PAPPA试剂灵敏度高，具有潜在的临床应用价值。

 

　　［关键词］ 妊娠相关血浆蛋白A；固相时间分辨荧光免疫；亲和素-生物素-聚乙烯胺-4,7二氯磺苯基1，10啡罗啉2，9二羧酸-铕复合物；唐氏综合征

 

　　Develop A Direct Solid Phase Lanthane Timeresolved Fluoroimmunoassay Reagent of PAPPAutilizing PVA

　　Abstract :Objective To develop a direct solid phase lanthane timeresolved fluoroimmunoassayreagent of PAPPA by synthesizing a complex of (SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+. Methods Polyvinylamine (PVA) was labeled with biotinstreptavidin and europium chelate of 4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacid(BCPDA). Using labeled PVA complex,We designed twosite sandwich timeresolved fluoroimmunoassay of PAPPA and evaluated assay characteristics of PAPPA kit .Results We successed synthesizing a conjuagete of (SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+ and a reagent of PAPPA. Detection limits achieved were 0.7mIU/L.The calibration curve was linear 010000mIU/L.Intra and interassay imprecision (CV) was 3.89%4.96% and 7.35%9.27%.Recovery was 95.8%104.2%. Conclusions The conjugate of (SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+ synthesizied was reactive ,highly fouorescent. A sorts of kit could be synthesized ,taking advantage of it. The reagent of PAPPA was potentially suited for use in clinical with highly analytical sensitivity.

 

　　Key words: Pregnancy associated plasma protein A;Direct solid phase lanthane timeresolved fluoroimmunoassay; StreptavidinbiotinPolyvinylamine europium chelate of 4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacid; Down's Syndrome

 

　　妊娠相关血浆蛋白A(Pregnancy associated plasma protein A，PAPPA)是一种高分子α2糖蛋白，20世纪70年代在孕妇血清中被发现［1］。在孕妇血中主要PAPPA是胎盘滋养层组织分泌，它是一种异源四聚体，由两个分子量为200 000~250 000亚基构成。PAPPA亚基和两个嗜红细胞主要基础蛋白(Proform of eosinophil major basic protein)以二硫键结合而成［2］，在孕妇血中只存在微量游离单体PAPPA。PAPPA亚基由1 547个多聚核苷酸构成，包括1个拉长的锌指结构，3个Lin-notch重复序列，以及5个短一致重复序列［3］。在体内PAPPA是一种蛋白酶，主要针对胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP4)和胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP5)起作用。胰岛素样生长因子I(IGFI)在促进细胞分裂和增殖起重要作用，它主要通过IGF1受体起作用，IGFI、II的生物活性受6个高亲和性IDFBP调节［4，5］。PAPPA主要用于产前筛查唐氏综合征(Down's Syndrome，DS)，迄今医学上对此病尚无有效的治疗和预防措施，只能通过产前筛查防止DS儿的出生，但目前开展的绒毛活检,羊水穿刺及脐带血穿刺均为侵入性检查,有1%～3%的流产率,且方法繁琐,出报告时间长,不适宜大范围孕妇的普查,仅限于高危人群的诊断。大量报道认为PAPPA可作为DS胎儿产前筛查的的标志物。在15周～20周通过结合孕妇孕周、超声诊断和FreeβHCG可以鉴别65%～75%，但要在3个月～6个月结合AFP、游离E3以及抑制素上述成分可鉴别85%～90%［6］。有文献［7］报道PAPPA在急性冠状动脉综合征(ACS)的早期诊断有一定的意义，PAPPA在ACS患者血清含量＜30 mIU/L，同时结构不同于孕妇体内的PAPPA且存在动态变化，必须利用超灵敏的方法进行检测。国内PAPPA的诊断试剂大多为ELISA和PerkinElmer公司生产的解离增强时间分辨荧光免疫分析(dissociated enhance lanthane timeresolved fluoroimmunoassay,DELFIA)试剂，无国产PAPPA时间分辨荧光试剂。我们利用PVA(聚乙烯胺)作为载体结合BCPDA镧系螯合物合成一种高灵敏的固相时间分辨荧光免疫分析(direct solid phase lanthane time resolved fluoroimmunoassay,DSLFIA)试剂。为提高检测灵敏度和克服BCPDA标记抗体使抗体失活的问题，我们引入了生物素亲和素(biotinstreptavidin system)系统。