【理学论文】中国特有植物血水草RAPD反应体系的优化

  摘要　为建立血水草的RAPD-PCR最佳反应体系,对影响血水草RAPD反应的Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物浓度和Taq聚合酶用量等因素进行优化。结果表明: 25μL反应体系中含10×Buffer2. 5μL, 1. 8mmol·L-1Mg2+, 2U TaqDNA聚合酶, 50 ng模板, 0. 2mmol·L-1dNTPs, 1. 6μmol·L-1引物。扩增程序为: 94℃预变性2min;预扩增: 94℃变性20 s, 36℃退火30 s, 72℃延伸75 s, 5个循环;扩增: 94℃变性20 s, 40℃退火30 s, 72℃延伸60 s, 40个循环; 72℃保温20min, 4℃保存。所建立的血水草RAPD-PCR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力强、重复性好等特点,可以较好地应用于血水草的遗传多样性分析研究。

    关键词　RAPD;反应体系;优化;　RAPD(Random Amplified PolymorphicDNA)技术是20世纪90年代初由W illiams和Welsh两个研究小组几乎同时建立的检测随机扩增多态DNA 的分子生物学技术[1]。RAPD分子标记技术具有周期短、费用低、多态性较高、灵敏度高、无辐射危险等特点,而且它能更全面地反映基因组的变异情况,是一种较理想的分子标记方法。目前,该项技术已广泛应用于种下水平遗传多样性的检测、探讨种间或属间的遗传关系、种质资源鉴定与分类、遗传图谱的构建、基因定位与分离、突变体的鉴定及育种材料等方面[2~6]。但是RAPD-PCR易受到试验条件的影响,结果的重现性不高。因此,建立精确的RAPD反应体系对保证RAPD试验的准确可靠非常重要。

   血水草(Eomecon chionanthaHance)为罂粟科 (Papaveraceae)血水草属(Eomecon)多年生草本植物,是我国单属单种的特有植物。血水草特产我国长江以南各省区和西南山区[7],西北秦岭也有分布[8]。血水草生长于荫凉潮湿的生态环境中,全草入药,具有清热解毒、活血止血之效,外用治湿疹、疮疖、无名肿毒、跌打损伤,内服治劳伤腰痛、肺结核、咳血等症[9]。目前有关血水草的研究国外未见报道,国内的研究也仅限于化学成分、药理活性及检测、主要成分的抑菌、杀钉螺效果、解剖学特征以及血水草生活的生态环境等方面[9~14]。作为一种野生中药材和观赏植物,血水草的资源有限, 而该物种野外资源已经存在逐步缩小的趋势,因此探讨血水草遗传多样性对该物种的保护、开发和利用极为重要和迫切。本试验通过严格控制反应条件和设置重复建立血水草的RAPD-PCR最佳反应体系,为深入开展血水草遗传多样性分析和种质资源保护等研究提供理论基础和技术保证。

  　材料根据血水草在井冈山实际的分布情况,按其分布海拔、生境条件、空间分布以及林分特征选择5 个种群用于遗传多样性研究(表1)。采样时,选定一个株群为中心,在距中心10m左右的距离上,分 4个不同的方向各选择一个株群随机采样4~5 株,共选择4个"+"形采样点,各种群选取16~20 个植株。采样时,为避免采集到的个体出自同一克隆植株,我们同时还将个体根茎挖开,以确保每个样本都是独立的个体。