【理学论文】薄荷属植物遗传多样性的ISSR分析

 　薄荷属是林奈 1753 年建立，当时记载只有 13种。目前据记载约有 30 个种左右，在我国有 12 个种。薄荷属植物是一类用途广泛的中药材，也是世界上主要的香料植物之一。从薄荷属植物茎、叶中提取的挥发油经加工后可得到薄荷脑和素油、薄荷油、椒样薄荷油、留兰香油等，被广泛地应用于医药、食品、化妆品、香料、烟草等工业。
　　简单重复序列区间扩增( ISSR，Inter Simple Se-quence Repeat) 标记技术是 Zietkiewicz 等在 1994 年提出来的一种标记技术。它以锚定的微卫星 DNA为引物，即在 SSR 序列的 3'或 5'端加上 2 ～ 4 个随机核苷酸，进行 PCR 反应时，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间 DNA 片段进行 PCR 扩增。ISSR 无需预知物种的 DNA 序列，具有操作简单，检测方便，遗传多态性高，重复性好等优点，因此广泛用于植物的遗传关系和遗传多样性分析、品种鉴定、遗传连锁图的构建等研究。本研究利用 ISSR 标记技术对我国薄荷属植物 7 个种 34 个居群的遗传多样性进行了分析，为薄荷属种质资源的评价和遗传育种提供了依据。
　　试验用的材料来源见表 1，共计 7 个种 34 个居群，包括薄荷( Mentha haplocalyx Briq. ) 、椒样薄荷( M. piperita L. ) 、留兰香( M. spicata L. ) 、假薄荷( M. asiatica Briss. ) 、灰薄荷( M. vagans Briss. ) 、兴安薄荷( M. dahurica Fisch. ) 和皱叶留兰香 ( M.crispata Schrad. ) 。采集幼嫩茎端部分用于 DNA 提取，用变色硅胶干燥，带回实验室后置 － 80 ℃ 冰箱保存。每个居群取 10 个单株，单株之间的距离保持在 10 m 以上。ISSR-PCR 反应体系 ISSR-PCR 反应体系体积为 20 μL，40 ng 模板 DNA，10 × PCR 缓冲液，Mg2 +浓度3. 0 mmol/L，dNTP 浓度0. 2 mmol/L，引物浓度 0. 3 mmol/L，TaqDNA 聚合酶 1U。
　　ISSR-PCR 反应程序 ISSR-PCR 反应程序如下: 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性40 s，58 ℃退火30s，72 ℃ 延伸 1 min，30 个循环; 72 ℃ 延伸 5 min。对扩增的电泳谱带进行统计，根据相同迁移率条带的有无统计条带的二元数据，有条带的记为"1"，无条带的记为"0"。用 POPGENE32 软件计算薄荷居群的多态位点百分率( PPL) 、种群总基因多样性( Ht) 、种群内基因多样性( Hs) 、种群间的遗传分化指数( Gst) 、Nei's 基因多样性指数( H) 、Nei' s 遗传距离( GD) 、遗传一致度( GI) 和Shannon's 信息指数( I) ，用 MEGA3. 1 软件进行聚类分析。多态性分析 选用 10 个带型清晰、多态性较好的 ISSR 引物用于 34 个薄荷材料的遗传多样性分析，ISSR 引物序列及扩增结果见表 2。10 个 ISSR引物共扩增出 68 条带，其中 59 条多态性条带，多态位点百分率为 86. 7%。ISSR 扩增产物片断大小在300 ～ 1 500 bp 之间。不同引物对扩增出的总带数、多态性带数及多态性位点百分率存在一定的差异。
　　其中 59 号引物扩增出多态性条带最多，为 8 条，多态位点百分率为 100. 0%。引物 851 扩增出的多态性条带最少，为 4 条，多态位点百分率为 80. 0%。部分引物的扩增。表 2 ISSR 引物序列及扩增结果引物 序列( 5'-3') 总带多态性条带多态位点百分率/%ISSR-32( AG)8AC 8 7 87. 5ISSR-35( AG)8TA 6 6 100. 0ISSR-42( AC)8CG 7 6 85. 7ISSR-43( AC)8CT 9 7 77. 8ISSR-44( AC)8GA 6 6 100. 0ISSR-56( AG)8TT 7 5 71. 4ISSR-58( AG)8GA 6 5 83. 3ISSR-59( AG)8GC 8 8 100. 0ISSR-77( ACTC)46 5 83. 3ISSR-851( CT)8G 5 4 80. 0总计 68 59 86. 73. 2 遗传多样性和遗传结构分析 ISSR 分析表明，34 个薄荷属材料的 Nei's 遗传多样性指数( H)为 0. 3457，Shannon's 信息指数( I) 为 0. 5166。这表明薄荷属种质之间存在丰富的遗传多样性。薄荷属材料不同居群内的遗传多样性存在较大差异。34 个薄荷居群中西藏芒康居 群 的 遗 传 多 样 性 最 高 ( H = 0. 1183; I =0. 1750) ，其次是甘肃张掖居群 ( H = 0. 1084; I =0. 1601) 和云南西双版纳居群 ( H = 0. 1009; I =0. 1456) 。遗传多样性较低的是留兰香河南商丘居群( H =0. 0602; I =0. 0902) 、皱叶留兰香西藏林芝居群( H =0. 0658; I =0. 0973) 和薄荷江苏东台居群( H= 0. 0651; I = 0. 0942) 。各居群的 Shannon' s 信息指数和 Nei's 基因多样性指数大小变化趋势基本一致。
　　由表 4 可以看出，34 个薄荷属植物总遗传多样性( Ht) 为 0. 3457，居群内遗传多样性 ( Hs) 为0. 0842，居群间的遗传分化指数( Gst) 0. 7564，说明75. 64% 的变异存在于薄荷居群间，24. 36% 的遗传变异存在于居群内。Slatkin 认为，当 Nm ＞ l，基因流可以抵抗遗传漂变的作用，发挥均质化作用，防止种群分化的发生;当 Nm ＜1，遗传漂变是种群遗传结构分化的主要原因。本研究中基因流 Nm 为 0. 1610，Nm ＜1，说明薄荷属居群间基因交流较小，而种群内遗传漂变在薄荷属植物的遗传分化中起了很重要的作用。通过聚类分析，将 34个薄荷属植物居群分为三大类，同一种的居群都聚在一起。第一大类包括薄荷和椒样薄荷 2 个种。第二大类包括假薄荷、灰薄荷和兴安薄荷 3 个种。第三大类包括留兰香和皱叶留兰香 2 个种。本研究发现，椒样薄荷和薄荷之间遗传系数很大，表明它们之间的亲缘关系很近。这一结论也支持了 Harley 认为椒样薄荷是由薄荷杂交得到的这一观点。