【医药学论文】灵龟八法开穴灸对阳虚模型大鼠外周血CD4CD8影响的实验研究

【摘要】目的：观察灵龟八法开穴灸对阳虚模型大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+的影响。方法：以醋酸泼尼松注射液（AHP）对大鼠进行肌肉注射以建立阳虚大鼠模型，比较运用灵龟八法开穴灸与穴位（足三里、肾俞）温和灸对模型大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+变化的影响。结果：灵龟八法开穴灸组和足三里、肾俞温和灸组模型大鼠与正常组大鼠外周血CD4+/CD8+比值变化无明显差异。结论：灵龟八法开穴灸法可以提高阳虚模型大鼠外周血T淋巴细胞免疫功能。

    中医学认为，阳虚是指机体阳气偏衰、正气不足，从而表现出一系列机能衰退，代谢减弱的病理状态[1]。研究显示免疫系统功能低下属于阳虚的范畴。CD4+、CD8+是T淋巴细胞的亚群，其比值是反映免疫系统功能状况的重要指标之一。大量临床实践表明灸法对治疗阳虚证有很好的疗效，而灵龟八法这种按时开穴的方法是中医学整体观念的重要体现，能提高针灸临床疗效。本实验主要从灵龟八法开穴灸法的角度来探讨灸法防治阳虚证的免疫学机理。
1.1 实验动物
1.2主要药品与试剂
1.3主要仪器设备
1.4实验方法
    选用SD大鼠，每只老鼠每天按照3mg/100g体重标准进行大腿外侧肌肉注射AHP，连续5天。大鼠出现背部拱起、身体蜷曲、四肢尾冷、蜷缩在一起、神情疲惫、反应呆滞、被毛疏松、暗淡无光、身体消瘦、食欲减退、不耐低温、精神萎靡、毛发脱落等虚损症状[1]。根据中医八钢辩证之阳虚证，辨证参考标准[2]，类似"阳虚"状态，说明此次试验所建立的阳虚大鼠动物模型属成功模型。
将建立好的阳虚模型大鼠按随机数字表随机分组，建立好的阳虚模型大鼠不予干预视为阳性空白对照组(A组)，足三里、肾俞温和灸组(B组)，灵龟八法开穴灸组(C组)，灵龟八法开穴灸结合足三里、肾俞温和灸组(D组)，正常大鼠视为阴性空白对照组(E组)，共5组，每组10只，雌雄分养。
B、C、D组大鼠每天每穴温和灸15分钟，左右交替进行，连续2周。灵龟八法开穴法依据《子午流注与灵龟八法临床应用盘》(魏晋盛主编，山西科学技术出版社，2010年10月，第一版)简易法选穴。A、E组大鼠只抓取，不做治疗。
1.5 观察指标及检测方法
  采用心脏采血法收集实验大鼠血液2ml快速放置在EDTA抗凝管中，以避免采集的标本发生溶血和凝血现象。
     标记后放入-20℃冰箱中保存。
1.5.2细胞标本
（2）六孔板中的细胞用PBS洗涤一次，加入1ml 0.25%胰酶消化细胞，待细胞变圆且有部分细胞              
     进行每分钟1500转离心5分钟，之后弃上清。
（4）沉淀加入100μl4℃预冷的PBS重悬细胞。
（6）每分钟1500转离心5分钟，弃上清。
（8）沉淀加入100μl预冷的PBS，重悬细胞。
（10）每分钟1500转离心5分钟弃上清，加入3ml PBS洗一次，加入100μl PBS 重悬。样品上                  
1.6 统计学方法

高希言等[111]选用D-半乳糖造成亚急性衰老小鼠为实验模型，随机分为艾灸督脉"大椎""命门""百会"穴组，空白对照组，与非经非穴部位作对照组，观察各组衰老小鼠的胸腺和脾脏指数、T细胞亚群中CD3+百分率、CD4+百分率、CD8+百分率以及CD4+／CD8+比值、可溶性IL-2受体含量。发现各造模组小鼠免疫功能较正常小鼠降低(P0.05).假手术组IL-1活性极显著降低(P< 0. O1)。IL-6比模型组明显为低(P< 0. 05)。模型组大鼠脾脏IL-2活性降低(P< 0. 05)，麦粒灸治疗后可使IL-2活性极显著升高(P< 0. O1)，麦粒灸加去肾上腺组IL-2活性与麦粒灸组及假手术组比(P< 0.05)，但与模型组比无显著性差异(P>0.05)。假手术组IL-2活性亦明显提高(P< 0. O1)，而与正常组无差异。得出结论，麦粒灸可抑制AA大鼠IL-1,IL-6活性。摘除肾上腺后则麦粒灸不能降低IL-1,IL-6活性;麦粒灸可明显提高IL-2活性，摘除肾上腺后麦粒灸则对IL-2活性无明显影响;麦粒灸对AA细胞免疫功能的调整与下丘脑一垂体一肾上腺的完整有关。
  足三里适应症众多，临床应用广泛。足三里又被称为下陵，鬼邪，中俞髎是胃经的下合穴，属于"四总穴"著名的"回阳九针"之一。此穴始载于《内经》，仅在《灵枢》中有关其主治运用的记载即达15处之多。随着针灸学的发展，其功效逐渐丰富，历代对其主治记载日广，《古法新解会元针灸学》曰："此穴治病万端，有白术之强，有桂附之热，有参茸之功，有硝黄之力"，故而成为临床常用要穴，历来就被推崇为补虚培元之要穴。孙思邈的《千金要方》曰："若要安，三里常不干"。《针灸资生经》:"若要安、丹田三里不曾干。"《灵枢·热病》曰:"中有寒，取三里"。《灵枢·四时气篇》:"着痹不去，久寒不已，卒取其三里。"华佗云:"五劳赢瘦，七伤虚乏，大小人热，皆调三里。"《针灸真髓》云:"三里养先天后天之气。"关于此类的论述在我们诸多古代医籍中比比皆是，说明足三里历代就被推崇为健脾补虚之要穴。它不仅可以作用疾病的反应点帮助诊断，也是治疗多种疾病的主穴，要穴。它对于机体的调节作用是双向的，"太过"可泻之，"不及"可补之。
    综上所述，足三里穴是阳明胃经之合穴，有调脾胃、养气血、扶正
灵龟八法与机体免疫功能的关系
       模型评价 
    在临床上，外周血CD4+, CD8+T淋巴细胞的绝对计数对于评价患者免疫功能和监测免疫抑制剂的使用有着重大的意义。本实验对大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+检测方法，选用的是流式细胞术。流式细胞术(FCM)是用一种在功能水平层面对单个细胞或生物粒子进行定量分析的检测手段。是细胞生物学、分子生物学、激光技术、电子计算机技术等学科的综合结晶。具有速度快、敏感性高、准确性好等优点[1.2]。
    1)标本的留取:对抗凝剂的选择十分重要，这一环节直接关系到采取的标本的质量。采用的抗凝剂是1%肝素钠注射液。抗凝剂的计量要与采取的血液的计量比例适当，以保证血液能充分抗凝同时保证血液不被过度稀释。因此有必要在采集血液之前，通过预实验的经验，提前计算好肝素用量的范围。在进行完采血工作后一定要将标本充分混匀，以保证其充分抗凝。
试剂的质控:使用试剂前需详细阅读试剂的说明说，操作时一定要严格按说明书执行。在测定时还要时刻注意FS, SS二维散点图，观察白细胞是否较好的分为三群(淋巴细胞，粒细胞，单核细胞)，如分群不好提示前期处理有问题，应寻找原因，必要时及时更换试剂。