【医药学论文】间充质干细胞在伊马替尼耐药中的作用研究

 摘 要

背景：伊马替尼治疗无效的慢性粒细胞白血病已被归因于静默白血病干细胞对伊马替尼无效。通过保护恶性祖细胞增殖和自我更新的功能，骨髓间充质干细胞可能导致了白血病的持续存在和进展。
从临床缺铁性贫血非白血病患者获取骨髓，以密度梯度离心法结合贴壁分离筛选法提取MSC；从慢粒慢性期病人取骨髓，在Ficoll 淋巴细胞分离液中离心获得慢粒单个核细胞；用免疫磁珠法分离CD34+慢粒祖细胞；以流式细胞术对上述细胞进行特性鉴定。慢粒细胞和人间充质干细胞共培养或慢粒细胞单独培养，加入1µM或5µM伊马替尼，用碘化丙啶染色锚定蛋白V双重染色定量（PI-Anexin V）测定伊马替尼诱导的细胞死亡率。用Western-blot法评价Bcl-XL和Bax蛋白在伊马替尼诱导凋亡中的保护作用。用定量迁移实验评价MSC对原代慢粒细胞的趋化功能。
成功分离出MSC及原代慢粒细胞，所获取MSC纯度>95％；CD34+细胞纯度>95％。伊马替尼诱导原代慢粒细胞凋亡具有剂量依赖性，与间充质干细胞共培养，保护了慢粒细胞。与间充质干细胞共培养，在伊马替尼浓度为1µM时，慢粒细胞死亡率从43.4±4.5降至26.9±6.1％，在伊马替尼浓度为5µM时，慢粒细胞死亡率从76.8±6.3降至56.5±5.0％。Western-blot测定表明，间充质干细胞升高了抗凋亡蛋白Bcl XL的表达约5～6倍。MSC上清液对原代慢粒细胞具有化学诱导活性，10.7 ±3.2%的原代慢粒细胞移向未稀释的上清液，迁移也是浓度依赖性的。
人间充质干细胞保护伊马替尼诱导的慢粒细胞凋亡。可能与升高了抗凋亡蛋白Bcl XL的表达有关。MSC上清液对原代慢粒细胞具有浓度依赖性的化学诱导活性

关键词:间充质干细胞；伊马替尼；耐药

前 言

慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）简称慢粒，是起源于造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病，目前认为其发病是9号和22号染色体间相互易位导致，9号染色体的abl原癌基因片段与22号染色体的bcr片段融合产生bcr／abl基因，编码酪氨酸激酶活性成分，干扰细胞信号传导通路而导致肿瘤发生。以前的治疗多以羟基脲为主，甲磺酸伊马替尼（Imatinib）问世后成为了慢粒治疗的首选药物。伊马替尼能竞争性地抑制酪氨酸激酶与ATP结合，阻止酪氨酸激酶活化，起到了靶向治疗的作用，使相当高比例的病人获得了持久的缓解，从而改变了慢性粒细胞白血病的治疗[1]。然而，大多数的患者最终还是会复发，其原因为低水平的残余病变。其中慢粒慢性期患者大约4％对伊马替尼存在原发耐药，而加速期及急变期耐药高达40％和90％左右[2]。伊马替尼对慢粒的治疗作用点并非肿瘤干细胞。在原代Lin–CD34+CD38–慢粒细胞中处于静止期的BCR/ABL阳性的白血病干细胞是可以被检测到的[3]，在伊马替尼治疗后仍然存活[3-6]。

综述

骨髓间充质干细胞的特性及临床应用进展

1867年，德国病理学家Cohnheimt发现骨髓内存在非造血功能的干细胞，1976年，Friedenstein和Petrakova成功分离、培养出骨髓间充质干细胞，并证实其具有多向分化潜能[1]。1991年Caplan将其定义为骨髓间充质干细胞[2]。

1.骨髓间充质干细胞的分离
成年人的骨髓间充质干细胞都是从骨盆髂骨中抽取，也可从胫骨、股骨、脊椎中获得。目前对骨髓骨髓间充质干细胞的分离、纯化主要有 5 种方法，包括贴壁分离筛选法、密度梯度离心法、免疫磁珠法,特制培养板筛选法、流式细胞仪分离法[5]。1）贴壁分离筛选法也称全骨髓贴壁培养法，是根据 MSCs 贴壁生长而造血干细胞悬浮生长的特性对两者进行分离。抽取骨髓后直接加入培养液制成细胞悬液，以合适的细胞浓度进行培养，早期造血细胞成分多，随时间造血细胞坏死，随换液而不断清除，培养皿表面包被细胞外基质成分如明胶等可促进MSCs 贴壁，并得以纯化。但所得细胞成分复杂，MSCs 的纯度不足。2）密度梯度离心法是根据骨髓间充质干细胞与其他细胞密度不同而采用淋巴细胞分离液将骨髓间充质干细胞分离出来, 再在培养瓶中培养，通过换培养基除去悬浮细胞，得到的细胞纯度达95％。操作快速, 对细胞的活性影响较小。3）免疫磁珠分离法即利用MSCs的细胞表面抗原与连接有磁珠的特异性单抗相结合,在磁场作用下分离细胞。4）特制培养板筛选法主要是根据细胞大小进行分离,即利用一种有3μm小孔的塑料培养皿从骨髓中筛选MSCs,其均质性>98%。5）流式细胞仪分离法根据MSCs的细胞表面标记,利用相应的荧光素标记抗体进行筛选。纯度高, 但细胞活性损失较大。故采用贴壁与密度梯度离心相结合,操作快速,对细胞的活性影响较小并每次传代严格掌握消化酶的量和消化时间, 保证骨髓间充质干细胞在短暂的作用时间内与培养瓶底分开, 淋巴细胞、单核细胞则因贴壁性强仍贴附与瓶底, 从而使骨髓间充质干细胞得到纯化。
2.骨髓间充质干细胞的表面标志
目前MSCs表面标记大体可分为以下几类[6-9]：1）粘附分子：整合素- αVβ3、整合素- αVβ5、整合素链α1～α5、整合素β1～β5、ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1、LAF-3、ALCAM-1、L-选择素、内皮素、CD44；2）细胞因子及生长因子IL-1α、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL15、LIF、SCF、Flt-3配体、GM-CSF、G-CSF、M-CSF；3）细胞因子及生长因子受体：IL-1R、IL-7R、IL-4R、IL-6R、LIFR、SCFR、G-CSFR、IFNR、TNF-ⅠR、TNF-ⅡR、TGF-β1R、TGF-β2R、BFGFR、PDFGR、EGFR；4）相对特异性抗原：SH2、SH3、SH4、STRO-1、α-平滑肌肌动蛋白、MAB1740；5）细胞外基质：胶原Ⅰ～Ⅳ型、蛋白聚糖、纤维结合素、透明质酸聚糖。

3.间充质干细胞的鉴定
4.间充质干细胞的分化潜能[12-13]
1)向骨细胞分化
2)向脂肪细胞分化
3)向肌细胞分化
4)向神经样细胞分化
5)向软骨细胞分化
5.间充质干细胞的免疫性特性
6.骨髓间充质干细胞在血液病中的应用
MSCs能分化成骨髓微环境中的各种细胞成分并分泌多种细胞因子，与造血细胞之间相互作用，对血液疾病的发展起了重要的作用。近年的研究发现，MSCs在白血病细胞恶性克隆的增殖、分化和凋亡中发挥重要作用，骨髓基质细胞能抑制化疗药物所致的白血病细胞凋亡[17]，对白血病细胞起保护作用，可能是因为MSCs使白血病细胞阻滞于G0/G1期，抑制了白血病细胞的自然增殖，从而使白血病细胞得到保护，与化疗药物耐药有一定关系。
再生障碍性贫血的发病也可能与MSCs的异常相关[19-20]。AA-MSCs与正常MSCs在形态学和免疫表型上一致，但前者的生物学特性有所不同。研究发现有以下特点：①AA-MSCs体外增殖能力减弱；②其抑制MLR和植物血凝素诱导T细胞增殖的能力明显降低；③抑制T细胞活化过程中IFN-γ的分泌能力也明显减低；④MSCs下调T细胞对克隆形成细胞的抑制效应的作用消失。从而造成患者体内细胞毒性T细胞过度增殖，破坏再行干细胞，减少造血干细胞池，最终导致再障的发生。
研究表明，在放化疗及移植前的预处理中，骨髓微环境受到破坏，MSCs受损，减弱了其对造血的支持及调控作用[21-22]。骨髓MSCs与HSCs共移植可促进造血重建，并降低GVHD的发生率及程度，保留GVL效应。在多个报道[23-26]中提到，加入MSCs共移植，并没有出现输注相关毒性，即使应用半相合MSCs也是安全的，且没有感染增加的趋势；在这些报道中，同样发现MSCs可明显增强CD34+细胞重建造血的能力，增加HSCs植入率，缩短造血重建的时间，并减少GVHD的发生率，降低急慢性GVHD的严重程度。MSCs在应用时间点选择上与HSCs同时植入的抑制作用明显，延迟应用或GVHD发生后应用则抑制作用减弱。其输注剂量和频次尚需进一步探索。目前观点认为：①MSCs对aGVHD有治疗价值，可能通过免疫抑制和促进肝肠粘膜愈合发挥作用。②持久的免疫抑制还需要环孢素A加激素。③MSCs可反复应用且效果稳定。④HLA不合的MSCs也不诱发异源性免疫反应，1×106/kg就有足够的免疫抑制作用。