【医药学论文】大鼠心肌缺血后适应（IPOC）和心肌TOLL样受体4（TLR）

 大鼠心肌缺血后适应（IPOC）和心肌TOLL样受体4（TLR4）在心肌再灌注损伤中的作用

急性心血管疾病在我国发病率逐年攀升，这不仅使心肌缺血再灌注治疗在临床应用增加（心肌缺血再灌注治疗包括溶栓、经皮穿刺冠状动脉介入治疗(percutaneous transluminal coronary internention ,PCI)和冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass graft,CABG等）。 同时也增加了心肌缺血再灌注损伤的发生。这是继急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）后，向临床医生提出的又一新的挑战。心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI）是在心肌缺血的急性心血管事件基础上，重新恢复冠脉血流之后，原缺血心肌组织损伤反而加重,甚至发生不可逆损伤的现象，比如心肌细胞加速死亡、心脏血流动力学持续障碍、出现再灌注心律失常，血管内皮功能障碍等[ 1]。在面对心肌缺血再灌注损伤的临床难题上，国内外已经进行了大量的动物实验研究及探索，并且已经找到了能够减轻这种再灌注损伤的方法。研究证明心肌缺血预适应(Ischemic preconditioning, IPC)，心肌缺血后适应(Ischemic postconditioning，IPOC)以及优化TOLL样受体4（Toll-like receptor-4, TLR4）等方法均可保护缺血再灌注心肌组织，减轻MIRI[2-4]。近期大量研究证明TOLL样受体4参与心肌缺血再灌注损伤，并且通过抑制TLR4受体，干预TLR4传导通路，可以对心肌缺血再灌注损伤发挥保护作用。目前国内外有研究表明将抑制TLR4及干预其通路与IPC相结合通过药物预处理缺血再灌注心肌，可以达到保护心肌缺血再灌注损伤的目的。2011年景桂霞[5]等在SD大鼠心肌缺血再灌注模型研究发现：与假手术组（Shame）组比较， IR组和七氟醚预处理（sP）组TLR4、核因子（Nuclear factor Kappa, NF-KB）和肿瘤坏死因子（TNF-a）的蛋白表达上调(P〈0．05)； 与IR组比较，sP组TLR4、NF-KB和TNF-a的蛋白表达下调(P〈0．05)。 病理学结果显示：SP组心肌细胞损伤较IR组减轻。 提示七氟醚预处理可通过抑制TLR4表达上调，降低炎性反应，从而减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。 但是在临床工作中我们不可能针对患者还未发生病变的某支血管进行反复的缺血及再灌注，以达到对将来可能出现病变的心肌进行保护的目的，这不符合医学伦理学。因此，预适应仍处于动物实验阶段，这也说明了预适应的局限性。为了弥补这一缺陷， 2003年赵[6]等提出了心肌缺血后适应（Ischemic postconditioning， IPOC）是心肌发生缺血后立刻对相应病变冠状动脉进行短暂的、多次的开通及再闭的过程，最后持续恢复冠状动脉血流。大量动物研究表明 ，心肌缺血后适应即对缺血心肌首先进行多次短暂的血管再通及缺血，也能达到"减少梗死面积，减缓心肌细胞凋亡，改善血管内皮功能，减轻缺血心肌水肿" [ 7-12 ]的目的。说明缺血后适应在保护缺血心肌保护作用上与预适应有同样的效果。心肌缺血后适应的操作方式预示着其临床推广的可能性较大。但是对于没有进行冠脉造影条件的患者，及医院，IPOC的治疗仍然存在很大的局限性。这要求我们能够进一步探索，研究新的，方便，有效，适合广泛推广临床的后适应治疗方法。假设是否存在某种药物，可以模拟后适应直接对冠脉的开通和再闭，作为接受溶栓，介入等血管再通治疗的补救治疗，那将大幅度提高缺血再灌注损伤的临床治疗价值。 本文就此设想，将进一步研究IPOC在心肌缺血再灌注损伤中的作用，研究心肌缺血再灌注损伤(I/R)，心肌缺血预适应(IPC)，心肌缺血后适应(IPOC)中TLR4的表达。 探讨IPOC与TLR4在心肌缺血再灌注损伤发挥其保护作用过程中的相关性，设想两种方法是否存在保护缺血心肌中存在相同或相近的机制，提出是否可能将IPOC与优化TLR4相结合，通过药物后适应治疗心肌缺血再灌注损伤。 为实验室寻找缺血再灌注损伤治疗方法上提供新的研究方向。
1.1实验动物
1.2主要试剂
（Nitro Blue Tetrazolium Chloride, NBT） 美国Amresco公司生产
EDTA抗原修复液 北京索莱宝科技有限公司生产
DAB显色试剂盒 上海铺镇生物科技有限公司生产
1.3主要器材：
型号：ECG-8110A， 深圳市奥生科技有限公司
型号 HX-300S 成都泰盟科技有限公司生产
电热恒温水浴锅
Olympus体式显微镜 日本奥林巴斯公司生产
1.4.1模型制作

造模结束后：处死大鼠，摘取大鼠心脏，每组随机分配：6只采用氯化硝基四氮唑兰（NBT）染色，显色后区分大鼠梗死心肌与未梗死心肌，然后用大鼠左心室梗死心肌重量除以大鼠左心室重量，计算出各组大鼠左心室心肌梗死面积百分比；另6只讯速用液氮冷冻后，转入-80℃冰箱进行保存，用Envision免疫组化方法，检测各组心肌TLR4表达。
摘取大鼠心脏，生理盐水反复冲洗，去除表面脂肪，血管等，并切除左、右心房以及右心室，只留下左心室（left ventriculum，LV），并称量左心室心肌重量（left ventriculum weight，LVW）。然后将左心室肌切成5片，每片约0.1cm厚，浸泡在0.1%氯化硝基四氮唑兰（Nitro Blue Tetrazolium Chloride ,NBT）溶液中,37℃温孵10min进行染色。染色结果：正常心肌被成紫蓝色,梗死心肌不染色。染色完成后，分离出未被染色的梗死心肌，并称量重量。 用未被染色的梗死区心肌重量（necrosis area weight，NAW ）除以大鼠左心室重量(LVW),得出结果为梗死区占左心室重的百分比，用该结果表示各组心肌梗死面积（infarction size，IS）IS=NAW/LVW。（见表1，图3）具体操作步骤如下：

1.4.4 TLR4检测
本实验选用Envision法染色方法，检测各组TLR4的表达，该方法具有以下特点：EnVision又称ELPS法，是一种两步法免疫组化技术。 EnVision免疫组化染色方法具有以下特点：第一方面，敏感性高，定位较确切：EnVision免疫组化染色方法，是将二抗与酶联接，成为一个多聚物，并且能直接将信号放大40-50倍，然后再和已经结合的一抗反应，后显色剂显色。 运用用此法可将一抗的稀释浓度提高到1～2倍，尤其时对抗原表达比较弱的组织。 尽管SP染色法的敏感度要高一些，但是在亲生物素含量较多的物质组织中不适用SP染色法。第二方面，染色效果好，EnVision染色方法，连接二抗和酶是在多聚物的基础之上，人体组织中不含有此种多聚物，故能避免生物素的干扰。从而得到较好的染色效果。另外EnVision染色方法需要时间较短，EnVision染色步骤分为两步，并且第二抗体孵育时间比较短。
实验中为了避免误差，注意以下几方面问题：1、样本数量，样本数量要尽量大，一般来说不能小于10个视野/观察点；本实验采取每一张切片随机选择3个不重叠的视野，每只标本共计15个视野。2、随机摄像；3、分析的时候要采用盲法，即分析者不能知道那张片子是哪一个组的，最好是同一个人一次分析完成，因为不同的人、不同的时间标准可能不一样，同时，其他人不能干涉分析者。4、免疫组化应该是同一批次，同一批试剂、同一条件下段时间内完成，照相时要同等条件。
本实验所得计量资料，用均数±标准差（x±s）来表示。软件采用SPSS20.0统计软件处理数据运用单因素方差分析检验方法，组间比较采用q检验，结果（p< 0.05）具有统计学意义。 2结果 2.1各组心肌梗死面积比较 IPC、IPOC两组和shame组比较，对大鼠左心室心肌梗死面积的影响，组织经NBT染色显示正常心肌染成蓝紫色，梗死心肌未染色，用NAW/LVW计算出左心室梗死心机重量占左心室重的百分比，以此来表示左心室梗死面积大小。结果为假手术组（shame）未见左心室梗死区，I/R组梗死区明显；与I/R组相比，左心室梗死面积在IPC和IPOC两组显著降低（P< 0.05），但IPC与IPOC两组间无显著差异（P>0.05），结果见表1,图5。
2.2各组心肌组织中TLR4表达比较
0.05）。 详见表2，图6。
通过上述实验研究发现IPOC可以减少缺血再灌注损伤心肌梗死面积，并且TLR4在IPOC组表达减少，这一结果是否说明IPOC可能影响TLR4及其通路从而达到缺血再灌注损伤心肌保护的作用，也就是说TLR4可能是后适应在缺血再灌注损伤中的保护机制之一，这需要进一步的研究和证实。
上世纪六十年代Jennings RB [14]等首先得出了心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）的概念，并把这种在心肌缺血基础之上恢复冠脉血流后心肌损伤再次加剧、甚至产生不可逆转的损伤的现象称为心肌缺血再灌注损伤。MIRI是心肌缺血，相应血管再通治疗之后，缺血心肌进一步损伤，表现为缺血心肌细胞迅速的凋亡和坏死，再次扩大心肌梗死面积，出现再灌注心律失常以及心肌收缩功能下降[15]。其主要发病机制可能与氧自由基增加、钙离子超载、炎症反应、心肌细胞凋亡等有关。心肌缺血再灌注引起的炎症反应的特点为，黏附分子上调，炎性细胞浸润，细胞因子释放。并通过上述不利因素的上升促进组织损伤再次加大。

4 结论