【医药学论文】“益肾调督”针灸法对AD模型大鼠海马神经元线粒体损伤

 目的：以线粒体损伤为中心，从线粒体超微结构、线粒体损伤三大途径（线粒体能量代谢障碍途径、线粒体动力学异常途径和线粒体通透性转换孔开放途径）方面出发，综合系统的探讨线粒体损伤机制与阿尔茨海默病发病机制之间可能存在的相关性及"益肾调督"针灸法防治AD过程中在线粒体损伤方面的可能作用机制。
方法：Wistar大鼠，SPF级、雄性、体重200±20g，80只，实验前所有大鼠置于鼠笼常规适应性喂养一周；实验时，经 Morris 水迷宫测试筛选，剔除先天性不符合评定标准的大鼠（定位航行试验中平均逃避潜伏期较短，空间探索实验中的跨越原平台次数和有效区停留时间较长者评定为不合格者，应给以剔除，补充相应合格者），采用双侧海马区（前囟后3.3mm，中线左右各旁开1.5mm，深度3mm）分别注射Aβ1-42（各5μL）的模型复制方法，以及进行Morris 水迷宫的模型评定方法（定位航行试验和空间探索实验的模型评价方法），通过《卫生统计学》随机数字表法将80只大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和针灸治疗组，每组20只，分笼饲养，并用苦味酸给予染色标记编号；正常组、假手术组（除注射等量的生理盐水外，其余同模型组处理方法）和模型组均进行相应处理后，正常饲养，不进行任何处理；针灸治疗组在模型复制成功后，先针刺百会穴（向前平刺3～5mm），双侧肾俞穴（稍向内斜刺5mm）后，选用特制艾条（Φ=0.6cm）于"百会"和"肾俞"穴位上方2～3cm处进行悬灸，使穴位表皮温度在43±1℃，持续15min，每日1次，7天为一个疗程，共计2个疗程，疗程间休息1日；运用透射电镜、免疫组化、免疫荧光、免疫印迹、RT-PCR等技术，通过观察各组大鼠海马神经元线粒体超微结构、线粒体能量代谢相关蛋白Aβ-结合性酒精脱氢酶蛋白ABAD与细胞色素氧化酶Ⅳ（COXⅣ）、线粒体动力学相关蛋白线粒体分裂蛋白1（Fis1）与内膜视神经萎缩1蛋白（Opa1）、线粒体通透性转换孔相关蛋白亲环蛋白D（CypD）等指标的变化，探讨"益肾调督"针灸法对线粒体损伤三大途径的影响。整个实验过程严格遵守国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。
结果：（1）"实验一"结果显示，模型组大鼠毛发光泽度降低，部分可见脱毛伴行动迟缓，进食饮水量有所减少，对外界刺激反应降低；运用透射电镜观察其海马CA1区神经元线粒体可见，线粒体形态呈卵圆形，但其数目较少，且分布不均，内嵴大部分排列紊乱，部分可见内嵴溶解消失，基质疏松，线粒体肿胀明显且部分空泡变性；周边内质网扩张，与正常组和假手术组具有明显的差异；而针灸治疗组大鼠皮毛尚有光泽，进食饮水量正常，对外界刺激反应尚可；运用透射电镜可见线粒体形态呈卵圆形，数目尚可，且分布均匀，内嵴尚清晰且排列尚可，少数可见嵴内腔轻微扩张及内嵴轻度溶解，基质尚均匀，未见线粒体肿胀及空泡变性；周边内质网轻度扩张，总体较模型组有所改善。（2）"实验二"结果显示，模型组大鼠海马神经元线粒体中ABAD的含量明显高于正常组和假手术组（P< 0.01），COXⅣ的水平明显低于正常组和假手术组（P< 0.01）；而针灸治疗组海马神经元线粒体中的ABAD的水平明显低于模型组（P< 0.01），COXⅣ的活性明显高于模型组（P< 0.01），且与正常组和假手术组之间无明显的差异（P>0.05），提示"益肾调督"针灸法具有抑制ABAD的过表达，提高COXⅣ活性的作用；（3）"实验三"结果显示，模型组大鼠海马神经元线粒体融合相关蛋白Opa1的水平明显低于正常组和假手术组（P< 0.01），线粒体分裂相关蛋白Fis1的水平明显高于正常组和假手术组（P< 0.01）；而针灸治疗组海马神经元线粒体中Opa1的水平明显高于模型组（P< 0.01），Fis1的水平明显低于模型组（P< 0.01），且与正常组和假手术组比较无统计学意义（P>0.05），提示"益肾调督"针灸法具有抑制Fis1的过表达，上调Opa1水平的作用；（4）"实验四"结果显示，模型组大鼠海马神经元线粒体中CypD的表达明显高于正常组和假手术组（P< 0.01）；而针灸治疗组可明显抑制大鼠海马神经元线粒体中CypD的过表达，与模型组比较具有明显的差异（P< 0.01），提示"益肾调督"针灸法具有下调CypD含量的作用。 结论：（1）"益肾调督"针灸法不仅整体上能够改善AD发病过程中的行为学变化，而且还能够在一定程度上改善AD发病过程中海马神经元线粒体超微结构的损伤；（2）"益肾调督"针灸法能够通过抑制Aβ-结合性酒精脱氢酶蛋白ABAD的过表达，有效地提高细胞色素氧化酶Ⅳ（COXⅣ）的活性，达到改善线粒体能量代谢的目的；（3）"益肾调督"针灸法能够有效地抑制线粒体分裂蛋白Fis1的过表达，提高线粒体融合蛋白Opa1的水平，从而调节线粒体分裂与融合的平衡，达到改善线粒体动力学异常的目的；（4）"益肾调督"针灸法能够有效地抑制线粒体通透性转换孔mPTP的必需成分之一，即亲环蛋白酶D（CypD）的过表达，从而抑制线粒体通透性转换孔的异常开放，达到改善线粒体膜内外渗透失衡的目的。因此，海马神经元线粒体损伤与阿尔茨海默病发病机制之间具有密切的相关性，且"益肾调督"针灸法可能通过改善海马神经元线粒体超微结构的病理改变及调节线粒体损伤三大途径的异常，进而改善线粒体损伤，达到防治AD的目的。 前 言 据报道，截止到2011年底，我国60岁以上的老年人口达1.85亿人，预计到"十二五"期末，全国老年人口将增加4300多万，占全球老年人口的23.2％，人口老龄化年均增长率高达3.2％，并且随着国民素质的提高，更多人准寻计划生育，加上医疗卫生事业的进步，推进我国老龄化的速度进一步加快。随着老年人身体机能逐步下降，老年人对医疗服务的需求也就快速提升，尤其是在目前我国已经进入老龄社会的背景下，针对老年人需要的老年医疗社会工作显得更为迫切[1-2]。其中，阿尔茨海默病，其发病率随年龄的增长而增长,85岁以上老年人的患病率则达30%以上,已成为继心脏病、肿瘤、中风后的人类第四大杀手。 阿尔茨海默病(Alzhemer's Disease,简称AD)，即老年性痴呆，是人类步入老年阶段时发生的一种与大脑皮质有关的神经系统退行性病理变化，与年龄具有密切联系，临床上主要可见进行性加重，思维记忆能力等出现异常，发病过久可失去生活自理的能力,给社会和家庭造成极大负担，是老龄化社会进程过程中必然问题 [3-4]。AD的最终发生和发展与Aβ的神经毒性、Tau蛋白异常磷酸化、神经胶质细胞增生、炎症反应和神经细胞凋亡等一系列病理机制有关。尽管引起AD的病因有很多, 但是近几年研究发现[5-6]，线粒体结构和功能与老年性痴呆存在着密切联系，线粒体损伤诱导轴突及轴突转运异常在老年性痴呆的发病过程中存在着密切的联系。当轴突发生肿胀或（和）轴突膨体也发生肿胀的时候，是轴突病理变化最为明显的表现，并且他们又会进一步导致二者的破坏，达成恶性循环的趋势。然而老年斑主要来源于不好的神经突起，主要由非正常状态下凝聚而成的病理状态下的轴突和前淀粉样蛋白酶及其代谢出来的东西组成[7-9]；其中关于线粒体的损伤相关机制的研究亦倍受关注[10]，并有相关学者提出"线粒体级联假说"，认为当线粒体损伤达到一定的阈值时即会引发相应的 AD 组织病理变化[11]。在AD的形成过程中，线粒体损伤不仅是早期事件，且随着AD病情的进展，神经元线粒体断裂也随之加重[12-13]。然而线粒体损伤机制不仅与线粒体结构异常有关，而且亦与线粒体能量代谢途径、线粒体动力学异常途径、线粒体通透性转化孔（mPTP）开放途径等密切相关。至于线粒体损伤与老年性痴呆的发病之间的具体可能机制，目前少见报道。 现今,国内外治疗AD的西药大多数处于临床实验中,且长期服用这类西医药物易引起严重的毒副反应,损害肝肾等器官。因此,从中医学方面探寻有效途径已成为国内外研究的主要趋势[14]。郭小溪等[15]按照循证医学的要求进行了全面的文献检索，结果显示针灸治疗老年性痴呆确有疗效，相对于其他疗法存在一定的优势, 且针灸防治AD具有早期性、功能性、良性双向调节等多方面的特点。因此，针灸防治是AD研究过程中的主要趋势之一。至于针灸防治AD是否与其改善线粒体损伤有关，目前少见报道。 中医学认为老年性痴呆以肾虚髓空为本，病变在脑。肾为先天之本，一身水火之宅，藏精主骨生髓，通于脑。脑为髓海，是元神之府，人的视、听、嗅、感觉及思维记忆等皆出于脑。若肾中精气不足，则脑髓失于充养，脑海空虚无以养脑守神，智力减退，发为痴呆。人至老年，肾衰髓虚，髓减则脑消，神机失用而成痴呆。故肾虚髓减、神机失用是痴呆发生的根本病机［16］，且针灸临床上常采用"百会"、"肾俞"等穴进行阿尔茨海默病的治疗，并具有一定的疗效［17-18］。因此，本研究根据临床上常用的穴位，以"益肾调督"为治疗原则，针刺加艾灸为治疗手段，选取"百会""肾俞"二穴，探讨针灸防治AD的可能有效机制。 导师孙国杰教授和课题组成员在前期实验研究中已证实[19-23]，针灸能够有效地预防和治疗AD模型大鼠的学习记忆障碍，调节wnt1信号系统，改善神经细胞凋亡，抗自由基损伤等多方面的作用。本研究在前期研究的基础上进一步深化，结合近几年研究热点，运用免疫学、分子生物学、超微病理学等相关技术，从线粒体超微结构与线粒体损伤三大途径出发，通过分析线粒体损伤机制与AD发病之间的关系，以期揭示"益肾调督"针灸法在AD发病过程中改善线粒体结构，保护线粒体功能、抑制线粒体损伤的可能有效机制，为临床治疗AD提供新的实验依据。